Principiul de funcționare al unei pipete Pasteur se bazează în principal pe debitul -gravitațional și pe acțiunea capilară, combinată cu controlul manual al diferențelor de presiune a aerului pentru a facilita aspirația și transferul lichidelor.
Control manual al aspirației: operatorul aplică aspirația la capătul lat al pipetei-fie pe cale orală, fie folosind un bec de cauciuc auxiliar-pentru a crea presiune negativă în tub, atrăgând astfel lichidul în vârful fin.
Gravitație-Distribuire: odată ce aspirația este eliberată, lichidul curge în mod natural sub influența gravitației; distribuirea poate fi asistată și prin strângerea ușoară a corpului pipetei sau înclinarea vasului de primire.
Reproductibilitatea picăturilor: prin calibrarea raportului de „picături pe mililitru”, pipeta permite transferul cantitativ aproximativ, făcând-o potrivită pentru proceduri care necesită repetabilitate mai degrabă decât precizie absolută.
Asigurarea sterilității: înainte de utilizare, un dop de bumbac poate fi introdus în capătul larg și sterilizat pentru a preveni contaminarea microbiană în timpul manipulării-o practică deosebit de comună în experimentele microbiologice.